食用菌菌種的液氮速凍保存方法

食用菌是指子實體碩大的蕈菌(大型真菌)，通稱為蘑菇。 具體地說食用菌是可供食用的蕈菌;蕈菌，是指能形成大型的肉質(zhì)(或膠質(zhì))子實體或菌核類組織并能供人們食用的一類大型真菌。

中國已知的食用菌有350多種，其中多屬擔(dān)子菌亞門，常見的有:香菇、草菇、蘑菇、木耳、銀耳、猴頭、竹蓀、松口蘑(松茸)、口蘑、紅菇、靈芝、蟲草、松露、白靈菇和牛肝菌等;少數(shù)屬于子囊菌亞門，其中有:羊肚菌、馬鞍菌、塊菌等。世界上已被描述的真菌達12萬余種，能形成大型子實體或菌核組織的達6000余種，可供食用的有2000余種。

藥用菌廣義的藥用菌指一切可以用于制藥的菌物，狹義指用于醫(yī)藥的大型真菌(蕈菌)。我國古代以其菇菌子實體、菌核等入藥，現(xiàn)代科技不僅實現(xiàn)許多藥用菌的人工馴化栽培，還能通過生物發(fā)酵、萃取等生物技術(shù)，利用其菌絲體及其代謝產(chǎn)物。野生有冬蟲夏草、蟬花、雷丸、安絡(luò)小皮傘等;目前，人工栽培的有靈芝、茯苓、豬苓、桑黃、木耳、云芝等。這些藥用菌在我國都有上千年的應(yīng)用歷史，它們雖功效不同，但最大的優(yōu)點，也是它們的共同點就是無毒副作用。近代醫(yī)學(xué)研究表明，它們不僅是傳統(tǒng)的益氣、強身、祛病、通經(jīng)、益壽等功能，還具增強人體免疫力，抗腫瘤抗癌的功效。許多食用菌兼具有藥用價值。

食用菌不僅味美，而且營養(yǎng)豐富，常被人們稱作健康食品，如香菇不僅含有各種人體必需的氨基酸，還具有降低血液中的膽固醇、治療高血壓的作用，還發(fā)現(xiàn)香菇、蘑菇、金針菇、猴頭中含有增強人體抗癌能力的物質(zhì)。食用菌中含有生物活性物質(zhì)如:高分子多糖、β-葡萄糖和RNA復(fù)合體、天然有機鍺、核酸降解物、cAMP和三萜類化合物等對維護人體健康有重要的利用價值。

用-150~-196℃的液氮超低溫保藏菌種，是現(xiàn)在菌種保藏中使用的一項先進技術(shù)。目前， 美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏委員會(American Type Cultur Collection，ATCC) 保存的17萬余株微生物菌種， 全部采用冷凍干燥和液氮超低溫法保藏。超低溫能使菌種的代謝水平降到最低，菌種基本上不發(fā)生變異。試驗證明，用這種方法能保存所有的食用菌菌種，包括一些不能用冷凍干燥法保藏的菌種。美國標(biāo)準(zhǔn)菌種保藏委員會曾用液氮法保藏了粗柄羊肚菌、大禿馬勃、墨汁鬼傘等培養(yǎng) 真菌，連續(xù)觀察了9年，發(fā)現(xiàn)這些菌種仍能保持良好的活力。也有人將蘑菇菌種在-160~-196℃下保藏22~26個月后，發(fā)現(xiàn)這些菌種仍完好無損。最有趣的V定 是怕冷的草菇在10%甘油保護下，居然也能在超低溫冰箱中保藏。

       雖然液氮保藏法有保藏的菌種不宜郵寄交流，還需要特殊的設(shè)備———液氮罐等缺點，但其保藏效果好、范圍廣、操作簡單，因此得到普遍應(yīng)用，其方法如下：

       (1)將保藏用的瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯煮汁1000mL、葡萄糖20g、酵母膏1.5g、磷酸二氫鉀1.5g、硫酸鎂0.5g、瓊脂20g)倒人無菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平或少 板，然后在平板中心接種食用菌菌絲，在適溫下培養(yǎng)至菌絲發(fā)滿平板。

(2) 保藏安部瓶的口徑約10mm， 大小為7.5mmx10mm， 內(nèi)盛經(jīng)滅菌的冰滿 凍保護劑0.8mL。冰凍保護劑常用10%甘油或10%二甲亞砜(DMSO) ， 需經(jīng)高壓滅菌后使用。

       (3)取直徑5mm的打孔器在菌落的外圍切割瓊脂塊，用無菌鑷子將這種帶有菌絲體的瓊脂塊移入滅菌的保藏安瓿瓶內(nèi)的保護劑中。注意在保藏菌種管上作永久標(biāo)記。也可直接用無菌保護劑制備菌懸液。

       (4)用火熔封安部瓶的瓶口。

       (5)將封好口的安部瓶放在慢速冷凍器內(nèi)，以每分鐘下降1℃的速度緩慢降藏 溫，直至-35℃左右，使瓶內(nèi)的保護劑和菌絲塊凍結(jié)。然后凍結(jié)速度不再控制，至到-150℃以下。將凍結(jié)的安部瓶立即置于液氮罐中保藏。液氮罐內(nèi)氣相溫度為-150℃，液相溫度為-196℃。

       (6)復(fù)蘇培養(yǎng)。啟用液氮超低溫保存的菌種時，應(yīng)先將安瓿瓶置于35~40℃的溫水中來回振蕩，使瓶內(nèi)的冰塊迅速融化，然后在無菌條件下開啟安瓿瓶，取懸浮的菌絲塊移植于適宜的培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)。

使用液氮超低溫法保藏菌種時，操作者要戴皮手套或棉手套，嚴(yán)防液氮飛濺傷人；取菌種時，要垂直輕取蓋塞，再垂直提起提筒，輕輕移到容器中取物。取畢立即將提筒與蓋塞復(fù)位，以防空氣中氮氣過濃引起窒息。